1938年，印第安纳·琼斯博士得知父亲老琼斯在寻找圣杯途中遭纳粹绑架，下落不明。原来，纳粹妄图借助圣杯获得永生之力，以统治世界。琼斯根据父亲留下的笔记本线索，与女冒险家艾莎并肩前往威尼斯，却意外发现纳粹的阴谋与圣杯墓地的秘密。为救父亲，琼斯在德国城堡与纳粹展开激烈交锋，最终成功救出老琼斯。但圣杯仍被纳粹抢走，父子二人被迫合作，循线索抵达约旦佩特拉古城。在传说中圣杯骑士守护的神庙里，琼斯必须通过三重考验：跪拜上帝、行走上帝之名、饮下上帝之杯。面对纳粹军官的致命枪伤，琼斯领悟圣杯的真正意义——选错杯子将付出生命代价。最终，他凭借谦卑与信仰找到真正的圣杯，救回父亲。但圣杯守护者告诫，圣杯必须留在神庙中。随着大地震颤，神秘的圣杯殿堂在眼前崩塌，父子二人骑马驰骋在落日余晖中，完成了这场关于信仰、亲情与勇气的传奇冒险。